La chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une technique analytique puissante et polyvalente, essentielle dans de nombreux domaines scientifiques et industriels, de la pharmacie à l'agroalimentaire en passant par l'environnement. Au cœur de cette technologie se trouve le concept de "gamme étalon HPLC", qui fait référence à l'ensemble des standards de référence utilisés pour calibrer et valider les méthodes d'analyse. Ces étalons, qu'ils soient de haute pureté ou des mélanges complexes, permettent de quantifier avec précision les composés d'intérêt dans un échantillon. Cet article explore les différents aspects de la gamme étalon HPLC, en abordant les phases stationnaires, les détecteurs, les paramètres de performance des colonnes, et les défis liés à l'étalonnage.
Les Composants Clés d'un Système HPLC
Avant de plonger dans les spécificités des gammes étalons, il est crucial de comprendre les éléments fondamentaux d'un système HPLC.
La Phase Stationnaire : L'Alumine et ses Propriétés
La forme particulaire poreuse d’oxyde d’aluminium (Al203) est un exemple de matériau utilisé comme phase stationnaire en chromatographie par adsorption en phase normale. L'alumine est caractérisée par une surface basique très active, avec un pH d’une suspension aqueuse à 10 % qui est d’environ 10. Pour ajuster son activité, elle peut être successivement lavée avec un acide fort pour obtenir des suspensions neutres et acides, de pH 7,5 et 4, respectivement. Il est important de noter que l’alumine est plus hygroscopique que la silice. Son activité est mesurée selon l’échelle de Brockmann† pour la teneur en eau.
La Colonne HPLC : Un Tube de Séparation
Une colonne HPLC est conçue pour contenir la phase stationnaire. Il existe différents types de colonnes, dont celle décrite comme un type de colonne, sans raccords d’extrémité, qui consiste simplement en un tube ouvert dans lequel le matériau de remplissage est retenu par un fritté à chaque extrémité. Les cartouches SPE peuvent fonctionner en parallèle sur un système manifold sous vide. Dans le contexte HPLC, les cartouches HPLC sont placées dans un porte-cartouche doté de raccords fluidiques intégrés à chaque extrémité.
Le volume géométrique de la partie du tube qui contient le remplissage est défini comme le volume de la colonne, calculé par la surface transversale interne du tube multipliée par la longueur du lit, en L. Le volume interparticulaire de la colonne, également appelé volume interstitiel, est le volume occupé par la phase mobile entre les particules dans le lit.
Le Détecteur : L'Œil du Chromatographe
Le détecteur est un appareil qui indique un changement de composition de l’éluant en mesurant les propriétés physiques ou chimiques (par exemple, l’absorbance de la lumière UV/visible, l’indice de réfraction différentiel, la fluorescence ou la conductivité). La présentation graphique ou autre de la réponse d’un détecteur ou d’une autre quantité utilisée comme mesure de la concentration de l’analyte dans les effluents en fonction du volume d’effluents ou du temps est appelée chromatogramme.
Si la réponse du détecteur est linéaire par rapport à la concentration de l’échantillon, il est possible de déterminer la quantité d’un composé moyennant un étalonnage adapté avec des étalons. Il est souvent avantageux d'utiliser deux types de détecteurs différents en série pour obtenir davantage d'informations corroborantes ou spécifiques. Certains détecteurs, comme les détecteurs électrochimiques ou les spectromètres de masse, sont destructeurs, modifiant chimiquement les composés de l'échantillon.
Les détecteurs de fluorescence, ou « fluorimètres », fonctionnent en excitant un échantillon avec une longueur d'onde de lumière donnée. Certains composés deviennent alors fluorescents et émettent de la lumière à une longueur d'onde plus élevée. Un capteur, réglé sur une longueur d'onde d'émission spécifique, recueille uniquement cette lumière émise.
L'appareil qui enregistre la réponse électrique d’un détecteur sur un écran d’ordinateur sous forme d’un chromatogramme est le système d'acquisition de données.
Les Principes de Séparation en HPLC
La séparation des composés dans un système HPLC repose sur divers mécanismes.
La Phase Mobile et la Force d'Élution
La phase mobile est le fluide qui percole, dans une direction définie, sur toute la longueur du lit de sorbant de la phase stationnaire. Elle peut être un liquide (chromatographie en phase liquide), un gaz (chromatographie en phase gazeuse) ou un fluide supercritique. En chromatographie en phase gazeuse, elle est désignée par l'expression gaz vecteur.
Le débit est le volume de phase mobile qui traverse la colonne par unité de temps. Il est réglé par le contrôleur du système de pompage de solvant (pompe). L'exactitude du débit peut être vérifiée par la collecte et la mesure des effluents. La vélocité linéaire, calculée en divisant le débit par la surface transversale de la colonne, est souvent utilisée pour comparer les conditions de séparation.
La force d'élution mesure l'affinité d’un solvant par rapport à celle de l’analyte pour la phase stationnaire. Un solvant faible ne déplace pas l'analyte, le laissant fortement retenu. Un solvant fort peut déplacer toutes les molécules d'analyte. Le moment dipolaire, la constante diélectrique, les liaisons hydrogène, la taille et la forme des molécules, ainsi que la tension de surface, influencent la force d'élution.
Une liste de solvants triés par force d’élution en référence aux analytes spécifiés sur un sorbant standard est appelée série d'élution. Elle est utile pour le développement de méthodes isocratiques et par gradient.
Modes de Séparation
- Chromatographie par élution : Procédure dans laquelle la phase mobile passe en continu à travers le lit de la colonne. Une fois le système à l'équilibre, un échantillon est introduit dans le flux de phase mobile.
- Chromatographie en phase normale : Procédure d'élution où la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile.
- Chromatographie en phase inversée : Procédure d'élution où la phase mobile est significativement plus polaire que la phase stationnaire (par exemple, un matériau microporeux à base de silice avec des chaînes alkyle chimiquement liées). Il convient d'éviter le terme incorrect "phase inversée".
- Chromatographie d'échange d'ions : Mode de séparation basé sur les différences d'affinité d'échanges d'ions des composés.
- Chromatographie d'exclusion stérique : Séparation basée principalement sur des différences de taille et/ou de forme des molécules. La chromatographie par perméation sur gel et la chromatographie par filtration sur gel en sont des exemples.
Principe général de la chromatographie HPLC
Caractérisation de la Performance des Colonnes
L'efficacité et la résolution d'une colonne sont des paramètres cruciaux pour obtenir de bonnes séparations.
Efficacité et Nombre de Plateaux
L'efficacité d'une colonne mesure sa capacité à résister à la dispersion d’une bande d’échantillon. Une colonne efficace réduit la dispersion ou l'étalement des bandes. Le concept de hauteur de plateau (H ou H.E.P.T.), introduit par Martin et Synge, est une mesure de l'efficacité. Ils ont reconnu qu'un lit homogène rempli de particules de la plus petite taille possible (nécessitant une pression plus élevée) était la clé d'une efficacité maximale.
Les chromatographistes calculent souvent le nombre de plateaux (N) à partir du chromatogramme. La hauteur de plateau est ensuite déterminée à partir du rapport de la longueur du lit de la colonne sur N (H = L/N).
Le nombre de plateaux théoriques (N) est un indicateur des performances de la colonne, mettant en relation la grandeur de rétention d'un pic avec sa largeur. Pour le calculer, on suppose qu'un pic suit une distribution gaussienne. La largeur d'une courbe gaussienne aux points d'inflexion est le double de l'écart-type (σ). La méthode 5 sigma est une mesure plus stricte de l'homogénéité et des performances de la colonne.
Résolution
La résolution (Rs) mesure la séparation de deux pics, exprimée comme la différence entre leurs temps de rétention, divisée par leur largeur de pic moyenne. Un Rs de 1,25 indique que deux pics de largeur égale sont juste séparés. Les colonnes à efficacité plus élevée améliorent la résolution, mais celle-ci n'augmente qu'avec la racine carrée de N.
Temps et Volume de Rétention
Le temps de rétention (tR) est le temps entre le début de l'élution et l'apparition du maximum du pic. Le volume de rétention (VR) est le volume de phase mobile élué pendant ce temps. Ils indiquent le délai durant lequel un composé est retenu par la phase stationnaire.
Développement de Méthodes et Étalonnage
La mise en place d'une méthode HPLC et l'utilisation d'étalons sont des étapes critiques.
Préparation des Échantillons et Phases Mobiles
Il est préférable de préparer les échantillons en les dissolvant dans la phase mobile pour éviter des problèmes de séparation. Si un autre solvant est utilisé, sa force d'élution doit être égale ou inférieure à celle de la phase mobile. Les bonnes pratiques HPLC impliquent que les échantillons et les phases mobiles soient exempts de particules.
Le gradient d'élution implique une variation dans le temps des concentrations relatives de solvants pour modifier la force d'élution. Un gradient discontinu change brutalement la composition, tandis qu'un gradient continu est généré par un système de mélange.
L'Étalonnage
L'étalonnage est essentiel pour la quantification. L'étalonnage externe utilise des solutions étalons de concentrations connues. L'étalonnage interne implique l'ajout d'un composé de référence (étalon interne) à toutes les solutions, y compris les échantillons. Cette méthode est utilisée lorsque la méthode manque de répétabilité ou de reproductibilité.
Un cas concret mentionné illustre les difficultés rencontrées : une gamme étalon pour le dosage de la vitamine C par HPLC a montré une différence notable entre deux courbes, avec un décrochage à basse concentration et une droite d'étalonnage "salement affine". Les questions soulevées portaient sur la sensibilité du détecteur, la lampe, et la possibilité d'un nettoyage de la cellule du détecteur UV. L'analyse spectrale a confirmé la présence d'un blanc réel à 245 nm, longueur d'onde de maximum d'absorption de l'acide L-ascorbique.
Les valeurs d'absorbance élevées peuvent suggérer une diminution du volume d'injection. Le nettoyage de la cellule du détecteur, potentiellement avec une solution d'acide phosphorique à 25 %, est une piste à explorer en l'absence de cet acide.
Applications et Perspectives
La gamme étalon HPLC est fondamentale pour diverses applications.
HPLC Analytique et Préparative
En HPLC analytique, l'objectif est de déterminer la concentration ou la masse des analytes. En HPLC préparative, le but est d'isoler un composé en quantité et pureté suffisantes pour des utilisations ultérieures. Les colonnes peuvent varier en diamètre, allant de quelques centimètres pour des applications de recherche à plusieurs pieds pour des procédés industriels.
Développements Futurs
La recherche continue d'améliorer les phases stationnaires, les détecteurs et les systèmes de pompage pour des séparations plus rapides, plus efficaces et plus sensibles. L'optimisation des gammes étalons est un processus continu pour répondre aux exigences croissantes de précision et de fiabilité dans l'analyse chimique.